了解復(fù)雜且快速變化的細胞動力學(xué)是深入探索生物進程的重要一步。因此，現(xiàn)代生命科學(xué)研究越來越需要關(guān)注于在分子水平上實時發(fā)生的生理事件。

 
 
觀察和分析活細胞時面臨的挑戰(zhàn)
在固定細胞或組織中，獲取樣品“分子狀態(tài)"的信息已是一項艱巨的任務(wù)。如果需要獲取實時信息，，就必須盡可能在實驗過程中保證細胞自然地運行生理機制，因此將加大實驗的困難程度。此外，由于很多生理過程的持續(xù)時間僅有幾秒甚至幾毫秒（例如細胞內(nèi)離子水平的變化），必須在相對較短的時間內(nèi)采集大量信息。
滿足這些挑戰(zhàn)性需求的一種方法是采用被統(tǒng)稱為活細胞成像的光學(xué)技術(shù)。活細胞成像可研究活細胞中的實時動態(tài)生理過程，而非提供細胞當(dāng)前狀態(tài)的一幅“快照"。它把快照轉(zhuǎn)變成了電影。活細胞成像可提供單個細胞、細胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)（原位）甚至整個生物體（體內(nèi)）中動態(tài)發(fā)生分子事件的空間和時間信息。這些特性讓活細胞成像成為了研究細胞生物學(xué)、癌癥、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)中動態(tài)生理過程的必要技術(shù)。
近年來，電子學(xué)、光學(xué)和生物化學(xué)的迅速發(fā)展，使得科學(xué)家們更輕松的實現(xiàn)活細胞成像。如今的活細胞成像方法使用優(yōu)化的顯微鏡、專用光源、高速相機、高靈敏度探測器和特異性的熒光標(biāo)記物，可同時提供技術(shù)成熟且仍具有創(chuàng)新性的全套解決方案，滿足在分子水平上對單細胞或整個細胞網(wǎng)絡(luò)進行實時研究的挑戰(zhàn)性需求。
使用線粒體標(biāo)記物(MitoRed®)和熒光鈣染料(Fluo-4)對細胞進行活細胞成像

 
圖1：熒光鈣染料Fluo-4標(biāo)記的睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)。鈣染料的位置類似于表征細胞內(nèi)的鈣分布。

 
圖2：線粒體標(biāo)記物MitoRed®染色的睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)。

 
圖3：圖1和圖2的疊加。觀察鈣斑和線粒體的共定位情況。

 
圖4：睪丸支持細胞的DIC圖像。
 
使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像軟件獲取的圖像。由德國亞琛工業(yè)大學(xué)生物II研究所化學(xué)感知系Sophie Veitinger博士提供。（地址：德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)細胞生物學(xué)和細胞病理學(xué)研究所）
對應(yīng)刊物（非圖片來源）：
 
活細胞成像中的常見問題
活細胞成像通常適用于培養(yǎng)的細胞系（例如HEK細胞、HeLa細胞）、原代細胞（例如皮膚細胞、神經(jīng)細胞）、急性制備的組織切片（例如腦切片）或整個器官或生物體。因為細胞被帶出其原本“自然"的培養(yǎng)環(huán)境并會受到光毒性的影響，所以在實驗過程中的首要任務(wù)是保持細胞的健康狀態(tài)。
 
細胞外溶液
不同類型的人工細胞外溶液（林格氏液、人工腦脊液(ACSF)）和培養(yǎng)基（例如Leibovitz L-15）用于為細胞提供維持其生理功能所必需離子和其他輔助因子。用于活細胞成像的培養(yǎng)基成分包括從極簡單的“含鹽"溶液（例如林格氏液）到非常復(fù)雜的混合物（例如Leibovitz L-15），種類繁多。
但所有溶液都有一個共同點，即都包含pH緩沖液，因為暴露在環(huán)境中之后，會顯著改變培養(yǎng)的pH（通常pH 7.2.-7.4）。在很多細胞外溶液中，pH緩沖液通過添加10–20 mM兩性離子有機化學(xué)品HEPES（2-[4-1-基]乙磺酸）來實現(xiàn)。但對于很多細胞來說，細胞外溶液不能用HEPES或其他化學(xué)緩沖液（例如MOPS、TES），因為培養(yǎng)基中缺乏pH緩沖碳酸氫鹽會對細胞造成傷害。要解決該問題，必須將二氧化碳輸送到細胞外溶液中（二氧化碳與細胞外溶液接觸時，會轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽）。這可以通過兩種方式實現(xiàn)：一種是不斷輸送氣態(tài)二氧化碳（通常以碳化物的形式：95%的氧氣和5%的二氧化碳）到細胞外溶液中，并不斷對細胞進行換液。這種方法通常用于代謝周轉(zhuǎn)率高于細胞增殖的切片制備。
另一種常見的方法是將細胞保存在可調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境氣體濃度和溫度（在很多情況下）的培養(yǎng)室中。在此類培養(yǎng)物中持續(xù)供應(yīng)5-7%的二氧化碳氣體，并且可以嚴(yán)格控制溫度。必須根據(jù)使用的樣品類型和實驗的持續(xù)時間，來確定化學(xué)緩沖的細胞外溶液是否足以使細胞保持良好狀態(tài)，或者是否需要輸送二氧化碳甚至使用培養(yǎng)小室。在很多情況下，化學(xué)緩沖溶液即可滿足細胞培養(yǎng)和短時實驗的要求。，因為急性切片代謝周轉(zhuǎn)率要高得多，通常需要足夠的二氧化碳供應(yīng)。但對于很多細胞類型和長時間成像實驗，必須使用培養(yǎng)小室。
 
光毒性
使用熒光染料進行活細胞成像的另一個問題是：激光或高強度電弧放電燈的入射光會損害細胞，即所謂的光毒性。光毒性主要在合成熒光染料被激發(fā)時發(fā)生。熒光染料被激發(fā)后，它們將與分子氧發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生自由基。為避免光毒性，必須選擇盡可能低的光強度和盡可能短的激發(fā)持續(xù)時間，以將入射高能光劑量保持在盡可能低的水平。在實驗設(shè)計過程中，還必須考慮實驗的持續(xù)時間。長時間實驗中，通常不需要高幀速率。因此，圖像采集的周期頻率通常可以從例如每秒10多幀降低到每秒1幀甚至更低。這將顯著降低樣品上的入射光劑量，從而大幅降低光毒性。
對于低強度熒光信號成像，可以考慮更改圖像采集條件設(shè)置，比如在大多數(shù)情況下，通過將相機功能用作像素合并或提高增益，甚至使用特殊的高靈敏度相機（例如EM-CCD相機）進行成像。這樣可以在不增加激發(fā)持續(xù)時間或光強度的情況下實現(xiàn)更好的信噪比和信號質(zhì)量，而這兩者都會導(dǎo)致更高的光毒性。此外，選擇具有長激發(fā)波長的熒光基團也可降低光毒性，因為與具有短激發(fā)波長的熒光基團相比，傳遞給樣品的能量更低。熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白(GFP)）的光敏位點位于被多肽包膜覆蓋的蛋白質(zhì)內(nèi)部，因此通常沒有光毒性。
 
焦面漂移
此外，在長時間的活細胞成像實驗中，很可能發(fā)生焦面漂移的問題，，。可以使用配備有軟件或硬件控制自動對焦的成像儀器來避免這種情況。

 
圖5：接種了豇豆花葉病毒(CPMV)的豇豆初生葉(Vigna unguiculata "California Blackeye")，在病毒RNA 2中的運動蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)之間的插入GFP基因。GFP以游離蛋白的形式大量表達（因此未融合于MP或CP），并且可以定位在受感染的表皮和葉肉細胞的細胞質(zhì)和細胞核中。由荷蘭瓦赫寧根農(nóng)業(yè)大學(xué)，生物分子科學(xué)部門分子生物學(xué)實驗室的Joan Wellink博士及植物科學(xué)部門病毒學(xué)實驗室的Jan van Lent博士提供。
 

 
視頻1：用DIOC6染色的活洋蔥球細胞，同時進行透射光檢測；使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP2 AOBS RS拍攝，63倍物鏡，1.5倍變焦，2倍線平均，掃描分辨率512 x 265，速度每秒4.7幀。

 
視頻2：用表達GFP融合蛋白的構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染的COS細胞。細胞溶質(zhì)蛋白在細胞中呈針狀分布。3D堆棧(10.14 µm，14層切)每5秒記錄一次，，持續(xù)10分鐘。本視頻使用了堆棧的最大投影。512 x 512像素，雙向掃描，變焦2倍，物鏡HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法國伊爾基希細胞生物學(xué)研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
 
用于活細胞成像的方法
可應(yīng)用于活細胞成像的寬場和共聚焦顯微技術(shù)的范圍也非常廣泛。通常，使用復(fù)式顯微鏡和反差對比方法（例如相差和微分干涉相差（DIC）），隨時間觀察細胞的生長、聚集或運動過程。此外，通常使用體視顯微鏡或宏觀鏡對大型標(biāo)本（例如發(fā)育中的斑馬魚胚胎）進行延時成像。在過去數(shù)十年中，先進熒光技術(shù)變得越來越重要。共聚焦顯微鏡應(yīng)用的迅速增加，使生物研究的視角從平面向三維立體轉(zhuǎn)變。